Mol Psychiatry︱郑玮/廖方团队合作揭示血管性认知障碍和痴呆中白质病变早期事件
撰文︱李 浩
责编︱王思珍
编辑︱杨彬伟
血管性认知障碍和痴呆（vascular cognitive impairment and dementia，VCID）是继阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）之后老年人第二常见的痴呆形式[1]，主要由大脑供血不足所引起。在所有痴呆病例中至少有一半存在脑血管病变[2-4]。VCID几乎涵盖了所有脑血管驱动认知障碍，从轻度认知障碍到完全发展的痴呆症，其主要病理特征为慢性脑灌流不足和微血管病理[7-10]，也同样是AD中的常见病变[11, 12]。目前科学界使用的几种模型虽然可以模拟VCID的多个病变过程，但由于疾病状态的异质性，限制了任何一种模型都无法完美展现该疾病全貌[13]。因此，迫切需要开发具有VCID代表性的动物模型，以更好地理解其潜在发病机制，明确临床前生物标志物，并指导制定临床预防和治疗策略。
健康的白质对形成正常认知至关重要[18]，同时也是血管损伤风险较高的区域。临床神经影像学和病理证据表明白质改变和神经退行性病变相关，最近通过不同细胞类型的单细胞RNA测序对AD前脑进行了全面转录组学研究，发现与髓鞘形成通路上的相关的基因是AD进展早期阶段发生变化最大的基因组[19]。然而，白质变化的确切分子机制和细胞机制尚不清楚。
2022年8月10日，中国医科大学基础医学院郑玮教授团队和田纳西大学医学院健康科学中心（UTHSC）廖方（Francesca-Fang Liao）教授团队在《分子精神病学》（Molecular Psychiatry）上发表了题为“White matter damage as a consequence of vascular dysfunction in a spontaneous mouse model of chronic mild chronic hypoperfusion with eNOS deficiency”的研究论文，提出内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide，eNOS）缺陷小鼠是一种研究白质改变早期事件的理想自发进化模型。作者建立eNOS-/-小鼠模型并发现，受损的血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）和轻度慢性低灌注引发血管损伤，以及氧化应激和星形胶质细胞增生，是eNOS-/-小鼠模型白质病变的原因。并确定了一氧化氮（NO）信号传导不足导致的BBB崩溃和低灌注是白质病变的最早病理事件。陈兴泳、陈凌、林庚、王正军、Mahesh C. Kodali为论文共同第一作者，郑玮教授和廖方教授为共同通讯作者。
作者之前研究业已发现eNOS+/-的小鼠在很小的年龄，就可以出现低灌注损伤[14]，与临床前AD患者脑内发现的低灌注区域惊人相似[15-17]，并且15月龄后的eNOS-/-小鼠会出现AD样病理特征[14]。在本研究中，作者选择三种不同年龄段（7、12和24月龄）eNOS-/-小鼠和同窝对照eNOS+/+小鼠作为研究对象，用组织学方法观察额叶至颞叶区域轴突和髓鞘蛋白标志物的变化。髓鞘染色（luxol fast blue，LFB）显示eNOS-/-小鼠从7月龄开始，皮质和胼胝体（corpus callosum，CC）中可见明显的髓鞘丢失，而纹状体没有明显变化（图1A）。免疫荧光结果显示，eNOS-/-小鼠中髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）的荧光强度明显低于对照组（图1B, C）。
图1 中年eNOS缺陷小鼠出现严重髓鞘丢失
（图源：Xingyong Chen et al., Mol Psychiatry, 2022）
大脑皮层白质改变常与人类步态功能障碍有关，因此作者使用CatWalk系统评估了12月龄的eNOS三种基因型小鼠步态表现。结果显示，eNOS+/-小鼠跑动速度明显下降，而eNOS-/-小鼠不仅速度更慢且无法维持恒速跑动（图2A）。此外，与eNOS+/+小鼠相比，eNOS缺陷小鼠（eNOS+/-和eNOS-/-）的步态序列肢间协调模式发生了显著改变。
通过新物体识别实验（Novel Object Recognition，NOR），作者发现年轻的eNOS缺陷小鼠（9月龄）出现了严重的NOR障碍（图2B），当其步入老龄后（15-18月龄），海马依赖的空间记忆能力也严重受损。在临床研究中发现，轻度认知障碍的患者出现与这一功能相关的皮质执行功能缺陷，要早于重度痴呆患者出现海马依赖的长期学习和记忆功能损伤[36]。
此外，作者应用LFB-Nissl双重染色观察eNOS-/- 和对照小鼠的皮质和海马区神经元的整体健康状况。结果显示，12月龄eNOS-/-小鼠皮质II/III 层和V/VI层锥体神经元呈现出严重的神经退行性变迹象，在变性神经元周围可见空泡（图2C），可能与髓鞘丢失有关。
图2 中年早期步态失衡、相关识别记忆受损和皮质锥体神经变性。
（图源：Xingyong Chen et al., Mol Psychiatry, 2022）
随后作者通过DHE染色观察到12月龄eNOS-/-小鼠顶叶皮质区ROS显著升高，尤其是II/III 和V层锥体神经元的ROS信号最强（图3A）。同时，免疫荧光结果显示，与eNOS+/+相比，12和24月龄eNOS-/-小鼠CC区中GFAP阳性的星胶数量显著增多，而小胶质细胞标记物Iba-1阳性细胞在12月龄的小鼠中未见差异，但在24月龄eNOS-/-小鼠CC区显著增多（图3BC）。
以上证据指出eNOS-/-小鼠中年或更早时期就开始出现白质损伤，12月龄显示出严重的髓鞘丢失和轴突病变并随年龄（24月龄）进行性加重，出现ROS升高、星形胶质细胞增生以及神经炎症等病理特征，表明eNOS-/-小鼠既有自发性白质病变，又具有年龄依赖的认知功能障碍，是研究白质病变机制的理想模型。
图3 活性氧（ROS）升高和星形胶质细胞增生。
（图源：Xingyong Chen et al., Mol Psychiatry, 2022）
内皮源性NO（Endothelium-derived NO，EDNO）信号对血管生成至关重要，作者通过FITC血管造影技术观察，发现幼龄eNOS-/-小鼠（3月龄)背侧视角观察到的血管荧光信号明显减弱，推测这种血管病变是由NO信号受损所致(图4B)，这与作者先前报道的eNOS-/-小鼠皮质中存在灌注不足和微血管闭塞中类似病变频率增加一致[14]。应用用于检测缺氧/缺血组织的羟基探针（hydroxyprobe），作者发现4月龄eNOS-/-和10月龄eNOS+/-小鼠皮层下低灌注区域范围增大，但这些低灌注现象在小鼠接受1 mM硝酸钠（sodium nitrate，SN）喂养后基本得以纠正(图4C)。研究中还发现中老年eNOS-/-小鼠存在BBB渗漏，渗漏多是右前向后的方向开始方(图4D, E )。白质轴突的关键功能是传递动作电位，髓鞘能够更快的传递脉冲[38]。作者随后评估了eNOS缺失对白质轴突神经电生理影响，细胞外复合轴突电位（extracellular compound axon potentials，CAPs）检测结果显示，CC交叉轴突CAP振幅快速N1成分在eNOS-/-小鼠中显著降低，SN喂养可以逆转这种效应，而N2成分在各组中均发生明显改变(图4F-H)。基于以上结果，作者认为eNOS-/-小鼠低灌注是慢性并且轻微的，eNOS-/-小鼠的BBB完整性和功能可能在低龄期已经出现了损伤。
图4 硝酸钠喂养后功能恢复。
（图源：Xingyong Chen et al., Mol Psychiatry, 2022）
接下来作者对eNOS+/+和eNOS+/-小鼠大脑白质和灰质区域进行了RNA高通量测序，从转录水平上进一步阐述了eNOS缺乏的影响。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）显示组织成分和基因型存在明显差异(图5A,B)。使用DESeq2鉴定发现eNOS+/+和eNOS+/-小鼠大脑灰质中有1968个基因（图5C），白质中有2112个基因（图5D）存在差异表达。随后作者确定了由灰质驱动的基因本体（gene ontology，GO）生物学过程 “长期突触增强调节”（GO：1900271）和“突触组装”（GO：0007416）相关基因变化模式，主要发生在白质的细胞呼吸（GO: 0045333）生物学相关基因发生明显改变（图5E, F）。GO富集分析显示，这些重要基因主要富集在细胞呼吸，氧化磷酸化，氧化应激反应以及突触发生，神经发生，轴突发生和神经元凋亡过程(图5G)。提示年轻时，eNOS缺乏主要改变白质的细胞呼吸。
图5 转录分析识别杂合eNOS(+/-)小鼠的白质变化。
（图源：Xingyong Chen et al., Mol Psychiatry, 2022）
Bmp4（bone morphogenetic proteins 4）蛋白是TGF-β1（transforming growth factor-β1）超家族中的一员，在血管性痴呆患者的大脑以及双侧颈总动脉夹闭的脑缺血小鼠大脑中上调[43]。作者发现，低龄eNOS-/-小鼠（5月龄）离体微血管Bmp4基因表达上调，Tgf-β1基因表达也上调(图6A），且Bmp4蛋白和TGF-β1蛋白水平升高更为显著，与灰质相比，在白质中尤为明显（图6B）。eNOS缺乏时BMP4免疫组化信号增加提示其来源于血管（图6C），这一结果得到了另一种方法的证实，即使用融合青色荧光蛋白基因（cyan fluorescent protein gene，CFP）BMP4启动子的BMP4报告小鼠模型[44]。CFP荧光信号和BMP4+核的细胞数量均表明，eNOS-/-小鼠在幼龄时额顶叶皮质降小动脉BMP4表达上调（图6D）。并且，Evans blue血管造影脑组织BMP4的免疫组化显示BMP4阳性染色与EB外渗几乎完全共定位（图6E），说明eNOS缺乏时，BMP4表达和分泌诱导血管病变，从而破坏BBB。作者利用体外BBB模型，通过重组BMP4蛋白（rBMP4）研究发现，rBMP4处理后第2天代表紧密连接的蛋白标记物ZO1，Claudin5和Glut1表达水平下降（图6F, G），BBB模型内皮电位同样下降，证实，eNOS缺乏小鼠在年轻时异常上调BMP4信号导致BBB渗漏。
图6 异常上调的BMP4信号传导对eNOS缺乏对BBB的潜在负面影响。
（图源：Xingyong Chen et al., Mol Psychiatry, 2022）
BMP4信号过度激活参与了BBB的损害。然而，受损的EDNO信号传导可能以潜在的细胞特异性方式诱导TGF-β1和BMP4信号转导，其机制尚不清楚，需要进一步研究。
总之，该研究首次发现了VCID中白质病变的早期病理改变，同时提供了用于研究白质病变的理想模型，有助于针对VCID和AD中血管机制的研究及候选药物的筛选和治疗测试。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41380-022-01701-9
第一作者：陈兴泳（前排左一）、Mahesh C. Kodali（前排右二）；通讯作者：郑玮（前排左二）、廖方（前排左三）
（照片提供自：美国田纳西大学健康科学中心廖方教授团队）
第一作者：陈凌（左二）、林庚（右一）；通讯作者：廖方（左一）
（照片提供自：中国医科大学郑玮教授团队）
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本文完